### 培养条件

本细胞培养的气相条件为95%空气与5%二氧化碳，适宜的培养温度为37℃。在首次传代时，建议采用1:2的传代比例。每两天需更换培养液。为了确保细胞运输的最佳状态，建议客户在收到细胞后，先将细胞处理至良好状态，再用完全培养液灌满，并封好瓶口。收到细胞后请勿立即开启瓶盖，及时核对培养瓶标注的细胞名称与实际订购名称是否一致，并检查瓶身是否有损坏或漏液等异常情况。

如未发现异常，建议在显微镜下观察细胞生长情况并拍照保存，拍照时最好使用40x、100x、200x的放大倍数各一张，前三天的照片将作为重要的售后依据。如未提供照片，则默认细胞状态良好。

### 贴壁细胞传代步骤

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次润洗。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟。透过显微镜观察细胞消化情况，若大部分细胞变圆并脱落，迅速将培养瓶取回操作台，轻轻敲打几下后加5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，悬浮液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，重新添加1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（将细胞分配到两个T25瓶中），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养。

### 悬浮细胞传代步骤

1. 使用半换液法处理时，将培养瓶竖立放置在培养箱中静置约1小时，轻轻吸走约3ml培养基，然后补充3ml的完全培养基；如培养基颜色变化缓慢，可以直接加入约500μl的FBS，进行传代时可以直接补充5ml培养基并分至两个培养瓶。通常这种传代方法使用3次后可进行离心以去掉死细胞。
2. 使用离心换液法时，如果需分瓶，可将细胞悬液收集到离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补充1-2ml的培养基后重悬，将细胞悬液按1:2的比例分至新的T25瓶中，添加6-8ml新配置的完全培养基以保持细胞活性，随后根据实际情况进行后续传代。

### 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞状态，当细胞回缩变圆时，加入5ml完全培养基终止消化，以轻轻吹打方式使细胞完全脱落，然后转移至15ml离心管中并在1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将细胞冻存管直接放入-80℃冰箱中，如果后期需要将细胞转移至液氮罐中，则需在-80℃冰箱中保存24小时后再转入液氮罐。

### 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（请注意佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中进行解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完成培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清液，使用5ml完全培养基重悬细胞，并接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2的细胞培养箱中进一步培养。
4. 次日更换为新鲜的完全培养基以继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，部分细胞由于附着力不牢可能会脱落，这是正常现象。如果观察到细胞脱落较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，并在1000RPM离心5分钟后，收集上清用作过渡培养。沉淀部分加入1-2ml胰酶，轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再进行离心并弃去上清液，添加1-2ml完全培养基进行重悬。最后按1:2的比例进行细胞分瓶传代，补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，再放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

#### 细胞问题处理与重发政策

若细胞在运输中遭遇丢失、瓶身破损或严重漏液等问题，会进行重发。污染问题亦可在收到产品48小时内提出真实实验结果验证后进行重发。对于细胞活性问题，我们需在收到产品7天内评估使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力。此外，收到细胞当天及以后两天内请及时拍照以备索赔。若前三天未及时告知问题，将视为产品合格。

对于一些由于客户原因导致的问题，如污染、错误操作等情况，我们将不予重发。只有在特定情况下丢失责任由双方协商处理，或按合同价格的50%进行补发。

在选择细胞培养产品时，请注意优质的服务以及细致的操作指引，尊龙凯时人生就博致力于为客户提供高品质的细胞培养解决方案，确保您的细胞实验顺利进行。