IPS诱导肠类器官培养的过程可以分为三大阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化以及中/后肠的模式化诱导和类器官的培养。在本文中，我们将详细介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制
（1）将hPSC Medium Supplement在2-8℃下解冻，融化后上下晃动均匀，按实际用量进行分装，立即使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融；
（2）按1:50的比例将10mL hPSC Medium Supplement加入到500mL hPSC Medium Basal Medium中，混合均匀，得到人多能干细胞培养基（abs9403）。需注意，混匀后的人多能干细胞培养基在2-8℃下可稳定储存2-3周，建议不要使用配制超过3周的培养基；
（3）实验试剂需平衡：在实验前将人多能干细胞培养基放置在室温下避光平衡，PBS和消化液等加热至37℃。切忌将培养基在37℃水浴加热，以免影响其稳定性。

二、操作方法

以下操作均应在无菌条件下进行：

hPSC细胞复苏

1. 实验操作步骤：
11. 基质胶包被培养板：将6孔板/12孔板取出，每孔分别加入1mL/0.5mL基质胶（abs9410），轻轻晃动使基质胶覆盖皿底，并在37℃培养箱中孵育1-2小时。实验前取出并在超净工作台中室温平衡20分钟。如暂不使用，封口后可在2-8℃下储存，建议在1周内用完。
注意：一支冻存的干细胞约含1×10⁶细胞，适用于6孔板1孔；即用型基质胶对温度敏感，当用即取，使用后及时放回4℃冰箱，避免直接用手触摸基质胶瓶身。
12. 取2-3mL的人多能干细胞培养基加入15mL离心管中备用。
13. 解冻：将液氮中取出的冻存管迅速浸入37℃温水中，快速摇动以在1-2分钟内快速解冻，尽量避免细胞暴露于室温中。
14. 离心：解冻后，逐滴将冻存液加入含干细胞培养基的15mL离心管中，平衡后，以1000rpm离心3分钟；
15. 重悬：离心后弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基，对细胞沉淀轻轻吹吸混匀，吹吸约3-5次。
16. 接种：将基质胶弃掉后，把均匀的细胞悬液添加到已经包被的6孔板中，使每孔补充至2mL的培养体系。
17. 培养：将接种后的6孔板放于倒置相差显微镜下观察细胞密度与团块大小，合格团块数量应为4个细胞以上，轻轻晃动以使细胞均匀分布，并在37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养。观察细胞贴壁情况，并于第2天进行记录；
18. 换液：自复苏时间开始，每24小时更换培养基一次。基于培养基中的活性成分只能维持一天，务必定期更换新鲜培养基。

hPSC细胞传代

2. 实验具体操作步骤：
21. 清洗：吸去原有培养基，贴壁细胞缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，再沿皿边吸去PBS；
22. 消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干细胞消化液（abs9409），使其覆盖皿底，并在37℃培养箱中孵育2-5分钟；消化时间依据细胞生长密度而异，建议消化时间为2-5分钟。期间可采用倒置显微镜观察细胞消化情况；
23. 吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，以扇形方式轻柔吹打皿底3-5次，使细胞脱落，并将细胞转移至15mL离心管中；
注意：在吹吸时要轻柔，避免形成单细胞。如有少量细胞未能脱落属正常，若大量细胞未能脱落，则需延长消化时间；
24. 离心：以1000rpm离心3分钟，沉淀后弃去上清；
25. 接种：用干细胞培养基轻轻吹打细胞5-10次，吸掉包被板中的基质胶，并将细胞悬液添加至培养板中，每孔补充至2mL的培养体系。
注意：在吹打细胞时应当温柔，且吹打次数不超过10次；
26. 换液：自传代时间开始，每24小时更换培养基一次，以确保适宜的生长环境。

hPSC细胞冻存

3. 实验具体操作步骤：
31. 清洗：与步骤21相同；
32. 消化：与步骤22相同；
33. 吹打：与步骤23相同；
34. 离心：与步骤24相同；
35. 重悬：减去上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412），轻轻吹吸混匀3-5次后，转移至冻存管中；
注意：冻存液应即用即取，及时返回4℃冰箱；
36. 记录：在冻存管上记录细胞种类、冻存时间、操作者及细胞批次；
37. -80℃冰箱冻存：将冻存管置于-80℃冰箱中过夜，注意冻存管应直立放置；
38. 液氮冻存：24小时后，将-80℃冰箱中的细胞移至液氮中进行长期冻存。

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