第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量

实时荧光定量PCR在基因表达分析中被广泛应用于测定不同样品中基因表达量的相对值。内参基因的选择至关重要，包括以下几点：

1. 选择表达丰沛且稳定的基因作为内参基因。
2. 避免盲目选择常用的内参基因。
3. 常用的内参基因有GAPDH、Actin和Tublin。

加入内参基因后，能够有效提升结果的可靠性，并进行进一步的结果计算。

二、绝对定量

绝对定量是基于标准品来测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。标准品可以是：

1. A/克隆质粒
2. B/PCR产物
3. C/cDNA（仅用于扩增效率测定等，绝对定量不可使用）

在计算拷贝数时，需首先确定平均分子量（MW）：

• 双链DNA（dsDNA）= (碱基数)x(660道尔顿/碱基)
• 单链DNA（ssDNA）= (碱基数)x(330道尔顿/碱基)
• 单链RNA（ssRNA）= (碱基数)x(340道尔顿/碱基)

拷贝数的计算公式为：

(602x10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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